अल्ट्राफिल्ट्रेशन सेंट्रीफ्यूज ट्यूबचा वापर आणि खबरदारी
1) योग्य अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब निवडा.लक्षात घ्या की यूएफ झिल्ली विविध रसायनांच्या सहनशीलतेच्या पातळीमध्ये भिन्न आहेत.सामान्यतः, 10 kDa आण्विक वजन कट-ऑफ असलेल्या अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब्स आण्विक वजन कट-ऑफसह निवडल्या जाऊ शकतात जे स्वारस्य असलेल्या प्रोटीनच्या आण्विक वजनाच्या 1/3 पेक्षा जास्त नसावेत, जसे की 35 kDa.स्वारस्य असलेल्या प्रथिनांचे आण्विक वजन सुमारे 10 kd असल्यास, 3 KD च्या आण्विक वजन कट-ऑफसह अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब वापरली जाऊ शकते.
(२) अल्ट्राफिल्ट्रेशन, ताजे विकत घेतलेले, कोरडे असते, वापरण्यापूर्वी अतिशुद्ध पाणी जोडले जाते आणि पाणी पूर्णपणे पडद्यामधून जाते, बर्फ आंघोळ किंवा रेफ्रिजरेटर काही मिनिटांसाठी थंड होते.नंतर पाणी ओतले जाते, म्हणजे प्रथिने द्रव, आणि किती जोडले जाते, जे ट्यूबच्या शीर्षस्थानी असलेल्या पांढऱ्या रेषेपेक्षा जास्त नाही.ऑपरेशन हलके आहे आणि प्रथिने द्रावण जोडण्यापूर्वी अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब बर्फावर थंड करणे आवश्यक आहे.
3) गुरुत्वाकर्षणाचे वस्तुमान आणि केंद्र दोन्ही समतोल गाठायचे होते.लक्षात घ्या की घूर्णन गती आणि प्रवेग फार वेगवान नाहीत, अन्यथा अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्लीला थेट नुकसान होते.सेंट्रीफ्यूगल अल्ट्राफिल्ट्रेशन सुरू केले होते (सेन्ट्रीफ्यूज 4 अंशांवर प्रीकूल केलेले).वेगवेगळ्या सेंट्रीफ्यूजचे RPM g मध्ये रूपांतरित झाल्यानंतर ते वेगळे होते.सेंट्रीफ्यूजचे प्रवेग कमीतकमी समायोजित केले गेले, ज्यामुळे पडद्यावरील दबाव कमी झाला.लक्षात ठेवा, सेंट्रीफ्यूजने त्याच्या गंतव्य गतीवर पोहोचल्यानंतर सेंट्रीफ्यूज सोडण्याची खात्री करा, किंवा तुम्हाला काही समस्या असल्यास, तुम्ही प्रथमच ते हाताळू शकत नाही.स्पिंडलच्या झिल्लीचे अभिमुखता निर्देशांनुसार समायोजित केले गेले होते (कोनीय सेंट्रीफ्यूज केस मेम्ब्रेन ते अक्ष लंब असतो).व्यावहारिक वापरात, सामान्य रोटेशन गती सूचनांपेक्षा कमी असते, ज्यामुळे सेंट्रीफ्यूज ट्यूबचे आयुष्य वाढवता येते.
3) गुरुत्वाकर्षणाचे वस्तुमान आणि केंद्र दोन्ही समतोल गाठायचे होते.लक्षात घ्या की घूर्णन गती आणि प्रवेग फार वेगवान नाहीत, अन्यथा अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्लीला थेट नुकसान होते.सेंट्रीफ्यूगल अल्ट्राफिल्ट्रेशन सुरू केले होते (सेन्ट्रीफ्यूज 4 अंशांवर प्रीकूल केलेले).वेगवेगळ्या सेंट्रीफ्यूजचे RPM g मध्ये रूपांतरित झाल्यानंतर ते वेगळे होते.सेंट्रीफ्यूजचे प्रवेग कमीतकमी समायोजित केले गेले, ज्यामुळे पडद्यावरील दबाव कमी झाला.लक्षात ठेवा, सेंट्रीफ्यूजने त्याच्या गंतव्य गतीवर पोहोचल्यानंतर सेंट्रीफ्यूज सोडण्याची खात्री करा, किंवा तुम्हाला काही समस्या असल्यास, तुम्ही प्रथमच ते हाताळू शकत नाही.स्पिंडलच्या झिल्लीचे अभिमुखता निर्देशांनुसार समायोजित केले गेले होते (कोनीय सेंट्रीफ्यूज केस मेम्ब्रेन ते अक्ष लंब असतो).व्यावहारिक वापरात, सामान्य रोटेशन गती सूचनांपेक्षा कमी असते, ज्यामुळे सेंट्रीफ्यूज ट्यूबचे आयुष्य वाढवता येते.
(4) उर्वरित 1ml वर केंद्रित केल्यावर, 50ul बफर द्रावण घ्या, 10ul प्रवाह जोडा आणि अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबमध्ये प्रथिने गहाळ आहेत की नाही याचा निर्णय म्हणून काही निळा रंग आहे का ते पहा.जर ट्यूब गळती असेल तर, अल्ट्राफिल्ट्रेशन सुरू करण्यासाठी वरचा थर पुन्हा ओता आणि नवीन ट्यूबमध्ये प्रवाहित करा.नलिका चुकल्या की नाही हे अचूकपणे निर्धारित करण्यासाठी, फ्लोथ्रूपूर्वी 5mgml BSA सह 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करा, प्रोटीन ग्लूवर चालवा किंवा ब्रॅडफोर्ड क्रूड परख करा आणि उर्वरित केंद्रित प्रोटीन सोल्यूशन (जे बर्फावर चालते आणि प्रथिने गरम होण्यापासून प्रतिबंधित करते) जोडून पुढे चालू ठेवा. सर्व एकाग्रता जोडली गेली आहे.सेंट्रीफ्यूगेशन दरम्यान काळजी घ्या जर प्रथिनांचा वर्षाव होत असेल, ज्यामुळे ट्यूब बंद होते.पर्जन्यवृष्टी होत असल्यास, पर्जन्यवृष्टीचे विशिष्ट कारण जास्त प्रथिने एकाग्रता किंवा अनुचित बफर आहे की नाही हे निर्धारित करा;अनेक अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब्सचे एकाच वेळी अल्ट्राफिल्ट्रेशन करून, एकाग्रता कमी करून, आणि नंतरचे प्रथिनांचा वर्षाव होत नाही तोपर्यंत वेगवेगळ्या बफर सोल्यूशन्सची देवाणघेवाण करून निराकरण केले जाऊ शकते.
(4) उर्वरित 1ml वर केंद्रित केल्यावर, 50ul बफर द्रावण घ्या, 10ul प्रवाह जोडा आणि अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबमध्ये प्रथिने गहाळ आहेत की नाही याचा निर्णय म्हणून काही निळा रंग आहे का ते पहा.जर ट्यूब गळती असेल तर, अल्ट्राफिल्ट्रेशन सुरू करण्यासाठी वरचा थर पुन्हा ओता आणि नवीन ट्यूबमध्ये प्रवाहित करा.नलिका चुकल्या की नाही हे अचूकपणे निर्धारित करण्यासाठी, फ्लोथ्रूपूर्वी 5mgml BSA सह 10 मिनिटांसाठी सेंट्रीफ्यूज करा, प्रोटीन ग्लूवर चालवा किंवा ब्रॅडफोर्ड क्रूड परख करा आणि उर्वरित केंद्रित प्रोटीन सोल्यूशन (जे बर्फावर चालते आणि प्रथिने गरम होण्यापासून प्रतिबंधित करते) जोडून पुढे चालू ठेवा. सर्व एकाग्रता जोडली गेली आहे.सेंट्रीफ्यूगेशन दरम्यान काळजी घ्या जर प्रथिनांचा वर्षाव होत असेल, ज्यामुळे ट्यूब बंद होते.पर्जन्यवृष्टी होत असल्यास, पर्जन्यवृष्टीचे विशिष्ट कारण जास्त प्रथिने एकाग्रता किंवा अनुचित बफर आहे की नाही हे निर्धारित करा;अनेक अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब्सचे एकाच वेळी अल्ट्राफिल्ट्रेशन करून, एकाग्रता कमी करून, आणि नंतरचे प्रथिनांचा वर्षाव होत नाही तोपर्यंत वेगवेगळ्या बफर सोल्यूशन्सची देवाणघेवाण करून निराकरण केले जाऊ शकते.
(५) पहिल्या काही पायऱ्या प्रथिने केंद्रित करण्यासाठी वापरल्या जातात, आणि जर बफर बदलायचा असेल, तर हळुवारपणे नवीन बफर (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेशन मेम्ब्रेनद्वारे अल्ट्राफिल्ट्रेशन) एकूण प्रथिनांपैकी सुमारे 1 मिली, आणि तीनसाठी सुमारे 1 मिली पुनर्केंद्रित करा. सलग वेळा, इच्छित प्रथिने एकाग्रतेवर अवलंबून अंतिम केंद्रित अंतिम खंडासह, साधारणपणे 500ul पेक्षा जास्त नाही, तर 200ul च्या आत देखील.तीन प्रसंगी 1000 × किंवा अधिक साध्य करा, मूलत: जास्तीत जास्त बफर बदल, प्रत्येक वेळी कमीतकमी 10 × किंवा त्यापेक्षा जास्त व्हॉल्यूम एनरिचमेंटने मोजले जाते.
(५) पहिल्या काही पायऱ्या प्रथिने केंद्रित करण्यासाठी वापरल्या जातात, आणि जर बफर बदलायचा असेल, तर हळुवारपणे नवीन बफर (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेशन मेम्ब्रेनद्वारे अल्ट्राफिल्ट्रेशन) एकूण प्रथिनांपैकी सुमारे 1 मिली, आणि तीनसाठी सुमारे 1 मिली पुनर्केंद्रित करा. सलग वेळा, इच्छित प्रथिने एकाग्रतेवर अवलंबून अंतिम केंद्रित अंतिम खंडासह, साधारणपणे 500ul पेक्षा जास्त नाही, तर 200ul च्या आत देखील.तीन प्रसंगी 1000 × किंवा अधिक साध्य करा, मूलत: जास्तीत जास्त बफर बदल, प्रत्येक वेळी कमीतकमी 10 × किंवा त्यापेक्षा जास्त व्हॉल्यूम एनरिचमेंटने मोजले जाते.
पोस्ट वेळ: नोव्हेंबर-०९-२०२२