आण्विक निदान, सामान्यतः वापरलेले पीसीआर तंत्रज्ञान आणि तत्त्व

पीसीआर, ही पॉलिमरेझ चेन रिअॅक्शन आहे, जी डीएनए पॉलिमरेझच्या उत्प्रेरकाच्या अंतर्गत प्रणालीमध्ये dNTP, Mg2+, विस्तार घटक आणि प्रवर्धक वाढ घटकांच्या जोडणीचा संदर्भ देते, पॅरेंट DNA चा टेम्पलेट म्हणून आणि विशिष्ट प्राइमर्सचा विस्ताराचा प्रारंभिक बिंदू म्हणून वापर करणे, डिनॅच्युरेशन, अॅनिलिंग, एक्स्टेंशन इ.च्या पायऱ्यांद्वारे, इन विट्रो रेप्लीकेटिंग कन्या स्ट्रँड डीएनए पॅरेंट स्ट्रँड टेम्पलेट डीएनएला पूरक बनवण्याची प्रक्रिया विट्रोमधील कोणत्याही लक्ष्यित डीएनएला जलद आणि विशेषत: वाढवू शकते.

1. हॉट स्टार्ट पीसीआर

पारंपारिक पीसीआरमध्ये प्रवर्धनाची सुरुवातीची वेळ पीसीआर मशीनमध्ये पीसीआर मशीन ठेवण्याची नाही आणि त्यानंतर प्रोग्राम वाढण्यास सुरुवात होते.जेव्हा सिस्टम कॉन्फिगरेशन पूर्ण होते, तेव्हा प्रवर्धन सुरू होते, ज्यामुळे विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन होऊ शकते आणि हॉट-स्टार्ट पीसीआर ही समस्या सोडवू शकते.

हॉट स्टार्ट पीसीआर म्हणजे काय?प्रतिक्रिया प्रणाली तयार झाल्यानंतर, प्रतिक्रियेच्या सुरुवातीच्या गरम अवस्थेत किंवा "हॉट स्टार्ट" अवस्थेत उच्च तापमानात (सामान्यत: 90 डिग्री सेल्सिअसपेक्षा जास्त) एंजाइम सुधारक सोडला जातो, ज्यामुळे डीएनए पॉलिमरेझ सक्रिय होते.अचूक सक्रियण वेळ आणि तापमान DNA पॉलिमरेज आणि हॉट-स्टार्ट मॉडिफायरच्या स्वरूपावर अवलंबून असते.ही पद्धत प्रामुख्याने डीएनए पॉलिमरेझची क्रिया रोखण्यासाठी ऍन्टीबॉडीज, ऍफिनिटी लिगॅंड्स किंवा केमिकल मॉडिफायर्स सारख्या सुधारकांचा वापर करते.खोलीच्या तपमानावर डीएनए पॉलिमरेझची क्रिया रोखली जात असल्याने, हॉट स्टार्ट तंत्रज्ञान PCR प्रतिक्रियांच्या विशिष्टतेचा त्याग न करता खोलीच्या तपमानावर एकाधिक पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली तयार करण्यासाठी मोठी सोय प्रदान करते.

2. RT-PCR

आरटी-पीसीआर (रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शन पीसीआर) हे mRNA मधून cDNA मध्ये रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनसाठी आणि प्रवर्धनासाठी टेम्पलेट म्हणून वापरण्याचे प्रायोगिक तंत्र आहे.प्रायोगिक प्रक्रिया म्हणजे प्रथम ऊती किंवा पेशींमधील एकूण RNA काढणे, प्राइमर म्हणून Oligo (dT) वापरणे, cDNA संश्लेषित करण्यासाठी रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्टेस वापरणे आणि नंतर लक्ष्य जनुक मिळविण्यासाठी किंवा जनुक अभिव्यक्ती शोधण्यासाठी PCR प्रवर्धनासाठी टेम्पलेट म्हणून cDNA वापरणे.

3. फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर

फ्लोरोसेंट परिमाणात्मक पीसीआर (रिअल-टाइम क्वांटिटेटिव्ह पीसीआर,RT-qPCR) PCR प्रतिक्रिया प्रणालीमध्ये फ्लोरोसेंट गट जोडण्याच्या पद्धतीचा संदर्भ देते, रिअल टाइममध्ये संपूर्ण पीसीआर प्रक्रियेचे निरीक्षण करण्यासाठी फ्लोरोसेंट सिग्नल जमा करणे आणि शेवटी टेम्प्लेटचे परिमाणात्मक विश्लेषण करण्यासाठी मानक वक्र वापरणे.सामान्यतः वापरल्या जाणार्‍या qPCR पद्धतींमध्ये SYBR ग्रीन I आणि TaqMan यांचा समावेश होतो.

4. नेस्टेड पीसीआर

नेस्टेड पीसीआर म्हणजे पीसीआर अॅम्प्लीफिकेशनच्या दोन फेऱ्यांसाठी पीसीआर प्राइमर्सच्या दोन सेटचा वापर करणे, आणि दुसऱ्या फेरीचे अॅम्प्लीफिकेशन उत्पादन लक्ष्य जनुक खंड आहे.

प्राइमरच्या पहिल्या जोडीच्या (बाहेरील प्राइमर्स) विसंगतीमुळे विशिष्ट नसलेले उत्पादन वाढवले ​​जात असेल, तर त्याच नॉन-विशिष्ट क्षेत्राला दुसऱ्या जोडीच्या प्राइमर्सद्वारे ओळखले जाण्याची आणि प्रवर्धित होत राहण्याची शक्यता फारच कमी आहे, म्हणून प्राइमरच्या दुसऱ्या जोडीद्वारे प्रवर्धन, पीसीआरची विशिष्टता सुधारली गेली आहे.पीसीआरच्या दोन फेऱ्या पार पाडण्याचा एक फायदा असा आहे की ते मर्यादित प्रारंभिक डीएनए पासून पुरेसे उत्पादन वाढवण्यास मदत करते.

5. टचडाउन पीसीआर

टचडाउन पीसीआर ही पीसीआर सायकल पॅरामीटर्स समायोजित करून पीसीआर प्रतिक्रियेची विशिष्टता सुधारण्याची एक पद्धत आहे.

टचडाउन पीसीआरमध्ये, पहिल्या काही चक्रांसाठी अॅनिलिंग तापमान प्राइमर्सच्या कमाल अॅनिलिंग तापमान (Tm) पेक्षा काही अंशांनी सेट केले जाते.उच्च अॅनिलिंग तापमान प्रभावीपणे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन कमी करू शकते, परंतु त्याच वेळी, उच्च अॅनिलिंग तापमान प्राइमर्स आणि लक्ष्य अनुक्रमांचे पृथक्करण वाढवते, परिणामी PCR उत्पन्न कमी होते.म्हणून, पहिल्या काही चक्रांमध्ये, प्रणालीमध्ये लक्ष्यित जनुकाची सामग्री वाढवण्यासाठी अॅनिलिंग तापमान सामान्यतः 1°C प्रति सायकलने कमी केले जाते.जेव्हा अॅनिलिंग तापमान इष्टतम तापमानापर्यंत कमी केले जाते, तेव्हा उर्वरित चक्रांसाठी अॅनिलिंग तापमान राखले जाते.

6. थेट पीसीआर

डायरेक्ट पीसीआर म्हणजे न्यूक्लिक अॅसिड अलगाव आणि शुध्दीकरण न करता थेट नमुन्यातून लक्ष्य डीएनएचे विस्तारीकरण.

थेट पीसीआरचे दोन प्रकार आहेत:

थेट पद्धत: थोड्या प्रमाणात नमुना घ्या आणि पीसीआर ओळखण्यासाठी थेट पीसीआर मास्टर मिक्समध्ये जोडा;

क्रॅकिंग पद्धत: नमुन्याचे नमुना घेतल्यानंतर, ते लाइसेटमध्ये जोडा, जीनोम सोडण्यासाठी लाइसे, थोड्या प्रमाणात लायस्ड सुपरनॅटंट घ्या आणि पीसीआर मास्टर मिक्समध्ये घाला, पीसीआर ओळख करा.हा दृष्टीकोन प्रायोगिक कार्यप्रवाह सुलभ करतो, वेळ कमी करतो आणि शुद्धीकरणाच्या चरणांमध्ये डीएनए नुकसान टाळतो.

7. SOE PCR

ओव्हरलॅप एक्स्टेंशन PCR (SOE PCR) द्वारे जीन स्प्लिसिंग पीसीआर उत्पादने आच्छादित साखळी बनवण्यासाठी पूरक टोकांसह प्राइमर्सचा वापर करतात, जेणेकरून त्यानंतरच्या प्रवर्धन अभिक्रियामध्ये, आच्छादित साखळ्यांच्या विस्ताराद्वारे, ए तंत्राचे वेगवेगळे स्रोत ज्यामध्ये प्रवर्धित तुकडे ओव्हरलॅप केले जातात. आणि एकत्र कापले.या तंत्रज्ञानामध्ये सध्या दोन मुख्य अनुप्रयोग दिशानिर्देश आहेत: फ्यूजन जनुकांचे बांधकाम;जनुक साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन.

8. IPCR

इनव्हर्स पीसीआर (IPCR) दोन प्राइमर्स व्यतिरिक्त इतर डीएनए तुकड्या वाढवण्यासाठी रिव्हर्स कॉम्प्लिमेंटरी प्राइमर्स वापरते आणि ज्ञात DNA फ्रॅगमेंटच्या दोन्ही बाजूंना अज्ञात अनुक्रम वाढवते.

आयपीसीआर मूलतः जवळच्या अज्ञात प्रदेशांचा क्रम निर्धारित करण्यासाठी डिझाइन केले गेले होते, आणि बहुतेक जनुक प्रवर्तक अनुक्रमांचा अभ्यास करण्यासाठी वापरले जाते;ऑन्कोजेनिक क्रोमोसोमल पुनर्रचना, जसे की जीन फ्यूजन, ट्रान्सलोकेशन आणि ट्रान्सपोझिशन;आणि व्हायरल जनुक एकत्रीकरण, देखील आता सामान्यतः वापरले जाते साइट-निर्देशित म्युटाजेनेसिससाठी, इच्छित उत्परिवर्तनासह प्लाझमिड कॉपी करा.

9. dPCR

डिजिटल पीसीआर (डीपीसीआर) हे न्यूक्लिक अॅसिड रेणूंच्या परिपूर्ण परिमाणासाठी एक तंत्र आहे.

न्यूक्लिक अॅसिड रेणूंचे प्रमाण मोजण्यासाठी सध्या तीन पद्धती आहेत.फोटोमेट्री न्यूक्लिक अॅसिड रेणूंच्या शोषणावर आधारित आहे;रिअल-टाइम फ्लोरोसेंट परिमाणवाचक पीसीआर (रिअल टाइम पीसीआर) सीटी मूल्यावर आधारित आहे, आणि सीटी मूल्य शोधले जाऊ शकणार्‍या फ्लोरोसेन्स मूल्याशी संबंधित सायकल क्रमांकाचा संदर्भ देते;डिजिटल पीसीआर हे न्यूक्लिक अॅसिडचे प्रमाण मोजण्यासाठी सिंगल-मॉलिक्युल पीसीआर पद्धतीवर आधारित नवीनतम परिमाणवाचक तंत्रज्ञान आहे, ही एक परिपूर्ण परिमाणात्मक पद्धत आहे.